Em um estudo liderado pelo Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz), pesquisadores desenvolveram, pela primeira vez, uma cepa geneticamente modificada da bactéria Mycobacterium leprae, causadora da hanseníase.
Cultivada a partir de células de carrapatos, a bactéria transgênica tem como característica principal a expressão de uma proteína fluorescente, que possibilita o monitoramento da atividade metabólica do microrganismo em tempo real.
"Esta nova metodologia poderá impulsionar o desenvolvimento de outros estudos, que visem, por exemplo, a busca por novos fármacos para o controle da hanseníase e a compreensão de como o M. leprae causa a doença", destacou Flávio Alves Lara, pesquisador do Laboratório de Microbiologia Celular do IOC e coordenador do estudo. Os achados foram publicados no periódico científico PLOS Neglected Tropical Diseases.
O microbiologista explica que, no caso da hanseníase, o cultivo da bactéria em laboratório ainda é um desafio. Atualmente, apenas modelos animais apresentam resultados satisfatórios na produção de M. leprae em número suficiente para uso como insumo de pesquisa.
Segundo Flávio, o desenvolvimento in vitro permitirá, entre outros benefícios, a redução do uso de animais de experimentação, a produção em larga-escala de antígenos e o desenvolvimento de novos estudos de modificação gênica para determinar a importância de proteínas de interesse na fisiologia do bacilo.
Segundo o pesquisador Flávio Lara, cultivo in vitro da bactéria causadora da hanseníase poderá levar ao desenvolvimento de novos estudos em busca de melhorias no diagnóstico e na identificação de resistência aos medicamentos usados no tratamento da doença. Foto: Gutemberg Brito/IOC/Fiocruz
A produção de patógenos causadores de doenças em ambientes controlados é um passo importante para o estudo dos fenômenos estruturais, bioquímicos e funcionais, assim como dos impactos que podem ser provocados no microrganismo pelos mais diversos agravos.
"A literatura científica evidencia que o bacilo se especializou para infectar com sucesso o nervo humano, abrindo mão de partes do próprio genoma. Isso faz com que o microrganismo dependa de proteínas ou metabólitos gerados pelo hospedeiro para sobreviver. Essa é uma das hipóteses que explicam a dificuldade de reproduzir o crescimento dessa bactéria em meio de cultura ou meio axênico, que é um ambiente livre de qualquer organismo vivo", explicou.
Os pesquisadores deram um passo importante ao promover o crescimento in vitro do M. leprae utilizando como base células embrionárias de carrapatos da espécie Ixodes scapularis (carrapato do veado).
A linhagem IDE8, conhecida por ser altamente permissiva a infecção por diferentes espécies de patógenos, apresentou os melhores resultados. Também foram testadas linhagens de células embrionárias de Hyalomma anatolicum, e derivadas de larvas da espécie Amblyomma variegatum.
As células de carrapatos apresentam características que facilitam o desenvolvimento do M. leprae, como um crescimento relativamente lento, a temperaturas entre 28°C e 33°C, e a capacidade de sobrevivência por longos períodos em um mesmo recipiente, demandando apenas trocas regulares do meio de cultura.
Culturas de células de carrapatos foram inoculadas com M. leprae com um marcador fluorescente de membrana (PKH67). Análises de citometria de fluxo e por microscopia confirmaram a associação da bactéria às linhagens testadas. Para investigar a capacidade da bactéria de se manter viável nas células, os pesquisadores determinaram o número total de bacilos presentes nas culturas nos períodos de duas horas, 10 dias e 20 dias após a infecção.
As células da linhagem IDE8 foram capazes de suportar um aumento detectável no número de bacilos ao longo de 20 dias, mostrando um tempo de duplicação in vitro de aproximadamente 12 dias, período semelhante ao observado em patas de camundongos em experimentos in vivo. Após 20 dias de cultivo, os bacilos foram coletados e utilizados para infectar camundongos, numa região das patas chamada coxim plantar.
Os pesquisadores confirmaram que, após seis meses, o M. leprae derivado das células IDE8 foi capaz de crescer dentro das patas dos camundongos. O experimento demonstrou a capacidade desta linhagem em manter a viabilidade e a infectividade do M. leprae.
"Descrevemos um protocolo para a produção in vitro de M. leprae em linhagem celular de carrapatos Ixodes scapularis IDE8. Acreditamos que essa metodologia irá mudar o paradigma dos estudos em hanseníase, tornando possível o cultivo contínuo in vitro e a geração de cepas modificadas de M. leprae, permitindo assim, o rápido progresso em várias áreas, incluindo a identificação de fatores de virulência e a descoberta de fármacos", ressaltou Flávio.
O sucesso obtido no crescimento da bactéria in vitro permitiu o desenvolvimento da primeira cepa transgênica de M. leprae. Isolada de um paciente multibacilar, a bactéria foi modificada por um processo chamado transfecção. Os cientistas utilizaram um plasmídeo [pCHERRY3] para codificar, no microrganismo, a proteína fluorescente mCherry, assim como a resistência ao antibiótico higromicina. As bactérias modificadas, designadas M. leprae-mCherry, cresceram dentro das células IDE8 e sobreviveram à exposição à higromicina, como pode ser visualizado pela divisão celular da bactéria em diferentes momentos.
Imagens de microscopia mostram o bacilo Mycobacterium leprae fluorescente, gerado por transfecção com o plasmídeo pCHERRY3 a partir de células da carrapato.
O avanço no desenvolvimento in vitro da primeira cepa transgênica de M. leprae foi obtido durante a realização de um amplo estudo sobre o potencial dos carrapatos como vetores da hanseníase. Ao infectar artificialmente fêmeas do carrapato-estrela (Amblyomma sculptum) com a bactéria M. leprae, os pesquisadores descobriram que os aracnídeos foram capazes de transmitir o microrganismo para a prole (transmissão vertical).
A descoberta foi evidenciada pela presença do RNA do bacilo no intestino e nos ovários das fêmeas e posteriormente nos ovos e larvas.
Em um segundo teste, os filhotes das fêmeas infectadas conseguiram inocular bactérias viáveis em coelhos ao se alimentarem do sangue dos animais.
"No estudo, apresentamos evidências da capacidade de A. sculptum de adquirir e transmitir, sob condições experimentais controladas, o bacilo M. leprae durante a alimentação sanguínea", frisou.
O pesquisador pondera que são necessários estudos complementares para afirmar que os carrapatos atuam como vetores da hanseníase. Pretendemos iniciar a busca por carrapatos naturalmente infectados com M. leprae, visando compreender melhor o papel dos carrapatos na transmissão da doença entre animais selvagens e humanos", acrescentou.
Segundo Flávio, as descobertas representam avanços importantes para a compreensão do ciclo de transmissão da hanseníase. Apesar do conhecimento estabelecido acerca do modo de transmissão - pelas vias áreas superiores (tosse ou espirro), por meio do convívio próximo e prolongado com uma pessoa doente sem tratamento , alguns aspectos da epidemiologia da doença permanecem desconhecidos.
Em especial, a sua distribuição geográfica. A doença, que tem se espalhado pelo mundo ao longo da história da humanidade, foi erradicada da Europa quase um século antes da descoberta da rifampicina, um dos principais medicamentos usados no tratamento, em 1965.
Hoje, o agravo acomete principalmente as populações de regiões tropicais. Apenas dois animais são conhecidos por atuarem como reservatórios naturais da bactéria responsável pelo agravo: os tatus, nas Américas, e os esquilos-vermelhos, no Reino Unido.
O primeiro relato da possível atuação dos carrapatos como vetores da hanseníase foi apontado na década de 1940 pelo pesquisador Souza Araújo, também do IOC, quando foram observados bacilos no intestino de carrapatos do gênero Amblyomma após alimentação sanguínea na lesão da pele de um paciente. Características como a ampla distribuição global e a baixa especificidade de hospedeiros tornam os carrapatos importantes transmissores de doenças infecciosas, como a febre maculosa e a doença de Lyme.
Outro fator importante envolvido é a habilidade biológica desses aracnídeos que permite a transmissão, das fêmeas para os filhotes, de um amplo espectro de patógenos, incluindo vírus, bactérias e protozoários.
O estudo contou com a participação de pesquisadores do Laboratório de Microbiologia Celular, do Laboratório de Hanseníase e do Laboratório de Biologia Molecular Aplicada a Micobactérias, do IOC. Também participaram especialistas da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), do Instituto Lauro de Sousa Lima, de Bauru, da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) e da Universidade de Liverpool, do Reino Unido.
Uma das doenças mais antigas da humanidade, a hanseníase foi conhecida por muitos anos como lepra. Desde a década de 1970, o Ministério da Saúde adota o termo hanseníase com o objetivo de minimizar o preconceito secular atribuído à doença.
O agravo atinge principalmente a pele e os nervos periféricos, podendo causar lesões neurais. As incapacidades físicas em decorrência da infecção são a principal causa de estigma e discriminação dos pacientes. O tratamento é realizado a partir da combinação de diferentes antibióticos, a chamada poliquimioterapia (PQT).
O Sistema Único de Saúde (SUS) disponibiliza a terapia e acompanhamento da doença em unidades básicas de saúde e em referências. Considerada pela Organização Mundial da Saúde como uma doença negligenciada, a hanseníase está fortemente relacionada às condições econômicas, sociais e ambientais desfavoráveis. No Brasil, as áreas de transmissão estão concentradas principalmente nas Regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste.
O país é o segundo no mundo com o maior registro de novos casos, ficando atrás apenas da Índia. Segundo dados do Ministério da Saúde, em 2017 foram registrados cerca de 26,8 mil novos casos em todo o território nacional.
Em um estudo liderado pelo Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz), pesquisadores desenvolveram, pela primeira vez, uma cepa geneticamente modificada da bactéria Mycobacterium leprae, causadora da hanseníase.
Cultivada a partir de células de carrapatos, a bactéria transgênica tem como característica principal a expressão de uma proteína fluorescente, que possibilita o monitoramento da atividade metabólica do microrganismo em tempo real.
"Esta nova metodologia poderá impulsionar o desenvolvimento de outros estudos, que visem, por exemplo, a busca por novos fármacos para o controle da hanseníase e a compreensão de como o M. leprae causa a doença", destacou Flávio Alves Lara, pesquisador do Laboratório de Microbiologia Celular do IOC e coordenador do estudo. Os achados foram publicados no periódico científico PLOS Neglected Tropical Diseases.
O microbiologista explica que, no caso da hanseníase, o cultivo da bactéria em laboratório ainda é um desafio. Atualmente, apenas modelos animais apresentam resultados satisfatórios na produção de M. leprae em número suficiente para uso como insumo de pesquisa.
Segundo Flávio, o desenvolvimento in vitro permitirá, entre outros benefícios, a redução do uso de animais de experimentação, a produção em larga-escala de antígenos e o desenvolvimento de novos estudos de modificação gênica para determinar a importância de proteínas de interesse na fisiologia do bacilo.
Segundo o pesquisador Flávio Lara, cultivo in vitro da bactéria causadora da hanseníase poderá levar ao desenvolvimento de novos estudos em busca de melhorias no diagnóstico e na identificação de resistência aos medicamentos usados no tratamento da doença. Foto: Gutemberg Brito/IOC/Fiocruz
A produção de patógenos causadores de doenças em ambientes controlados é um passo importante para o estudo dos fenômenos estruturais, bioquímicos e funcionais, assim como dos impactos que podem ser provocados no microrganismo pelos mais diversos agravos.
"A literatura científica evidencia que o bacilo se especializou para infectar com sucesso o nervo humano, abrindo mão de partes do próprio genoma. Isso faz com que o microrganismo dependa de proteínas ou metabólitos gerados pelo hospedeiro para sobreviver. Essa é uma das hipóteses que explicam a dificuldade de reproduzir o crescimento dessa bactéria em meio de cultura ou meio axênico, que é um ambiente livre de qualquer organismo vivo", explicou.
Os pesquisadores deram um passo importante ao promover o crescimento in vitro do M. leprae utilizando como base células embrionárias de carrapatos da espécie Ixodes scapularis (carrapato do veado).
A linhagem IDE8, conhecida por ser altamente permissiva a infecção por diferentes espécies de patógenos, apresentou os melhores resultados. Também foram testadas linhagens de células embrionárias de Hyalomma anatolicum, e derivadas de larvas da espécie Amblyomma variegatum.
As células de carrapatos apresentam características que facilitam o desenvolvimento do M. leprae, como um crescimento relativamente lento, a temperaturas entre 28°C e 33°C, e a capacidade de sobrevivência por longos períodos em um mesmo recipiente, demandando apenas trocas regulares do meio de cultura.
Culturas de células de carrapatos foram inoculadas com M. leprae com um marcador fluorescente de membrana (PKH67). Análises de citometria de fluxo e por microscopia confirmaram a associação da bactéria às linhagens testadas. Para investigar a capacidade da bactéria de se manter viável nas células, os pesquisadores determinaram o número total de bacilos presentes nas culturas nos períodos de duas horas, 10 dias e 20 dias após a infecção.
As células da linhagem IDE8 foram capazes de suportar um aumento detectável no número de bacilos ao longo de 20 dias, mostrando um tempo de duplicação in vitro de aproximadamente 12 dias, período semelhante ao observado em patas de camundongos em experimentos in vivo. Após 20 dias de cultivo, os bacilos foram coletados e utilizados para infectar camundongos, numa região das patas chamada coxim plantar.
Os pesquisadores confirmaram que, após seis meses, o M. leprae derivado das células IDE8 foi capaz de crescer dentro das patas dos camundongos. O experimento demonstrou a capacidade desta linhagem em manter a viabilidade e a infectividade do M. leprae.
"Descrevemos um protocolo para a produção in vitro de M. leprae em linhagem celular de carrapatos Ixodes scapularis IDE8. Acreditamos que essa metodologia irá mudar o paradigma dos estudos em hanseníase, tornando possível o cultivo contínuo in vitro e a geração de cepas modificadas de M. leprae, permitindo assim, o rápido progresso em várias áreas, incluindo a identificação de fatores de virulência e a descoberta de fármacos", ressaltou Flávio.
O sucesso obtido no crescimento da bactéria in vitro permitiu o desenvolvimento da primeira cepa transgênica de M. leprae. Isolada de um paciente multibacilar, a bactéria foi modificada por um processo chamado transfecção. Os cientistas utilizaram um plasmídeo [pCHERRY3] para codificar, no microrganismo, a proteína fluorescente mCherry, assim como a resistência ao antibiótico higromicina. As bactérias modificadas, designadas M. leprae-mCherry, cresceram dentro das células IDE8 e sobreviveram à exposição à higromicina, como pode ser visualizado pela divisão celular da bactéria em diferentes momentos.
Imagens de microscopia mostram o bacilo Mycobacterium leprae fluorescente, gerado por transfecção com o plasmídeo pCHERRY3 a partir de células da carrapato.
O avanço no desenvolvimento in vitro da primeira cepa transgênica de M. leprae foi obtido durante a realização de um amplo estudo sobre o potencial dos carrapatos como vetores da hanseníase. Ao infectar artificialmente fêmeas do carrapato-estrela (Amblyomma sculptum) com a bactéria M. leprae, os pesquisadores descobriram que os aracnídeos foram capazes de transmitir o microrganismo para a prole (transmissão vertical).
A descoberta foi evidenciada pela presença do RNA do bacilo no intestino e nos ovários das fêmeas e posteriormente nos ovos e larvas.
Em um segundo teste, os filhotes das fêmeas infectadas conseguiram inocular bactérias viáveis em coelhos ao se alimentarem do sangue dos animais.
"No estudo, apresentamos evidências da capacidade de A. sculptum de adquirir e transmitir, sob condições experimentais controladas, o bacilo M. leprae durante a alimentação sanguínea", frisou.
O pesquisador pondera que são necessários estudos complementares para afirmar que os carrapatos atuam como vetores da hanseníase. Pretendemos iniciar a busca por carrapatos naturalmente infectados com M. leprae, visando compreender melhor o papel dos carrapatos na transmissão da doença entre animais selvagens e humanos", acrescentou.
Segundo Flávio, as descobertas representam avanços importantes para a compreensão do ciclo de transmissão da hanseníase. Apesar do conhecimento estabelecido acerca do modo de transmissão - pelas vias áreas superiores (tosse ou espirro), por meio do convívio próximo e prolongado com uma pessoa doente sem tratamento , alguns aspectos da epidemiologia da doença permanecem desconhecidos.
Em especial, a sua distribuição geográfica. A doença, que tem se espalhado pelo mundo ao longo da história da humanidade, foi erradicada da Europa quase um século antes da descoberta da rifampicina, um dos principais medicamentos usados no tratamento, em 1965.
Hoje, o agravo acomete principalmente as populações de regiões tropicais. Apenas dois animais são conhecidos por atuarem como reservatórios naturais da bactéria responsável pelo agravo: os tatus, nas Américas, e os esquilos-vermelhos, no Reino Unido.
O primeiro relato da possível atuação dos carrapatos como vetores da hanseníase foi apontado na década de 1940 pelo pesquisador Souza Araújo, também do IOC, quando foram observados bacilos no intestino de carrapatos do gênero Amblyomma após alimentação sanguínea na lesão da pele de um paciente. Características como a ampla distribuição global e a baixa especificidade de hospedeiros tornam os carrapatos importantes transmissores de doenças infecciosas, como a febre maculosa e a doença de Lyme.
Outro fator importante envolvido é a habilidade biológica desses aracnídeos que permite a transmissão, das fêmeas para os filhotes, de um amplo espectro de patógenos, incluindo vírus, bactérias e protozoários.
O estudo contou com a participação de pesquisadores do Laboratório de Microbiologia Celular, do Laboratório de Hanseníase e do Laboratório de Biologia Molecular Aplicada a Micobactérias, do IOC. Também participaram especialistas da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), do Instituto Lauro de Sousa Lima, de Bauru, da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) e da Universidade de Liverpool, do Reino Unido.
Uma das doenças mais antigas da humanidade, a hanseníase foi conhecida por muitos anos como lepra. Desde a década de 1970, o Ministério da Saúde adota o termo hanseníase com o objetivo de minimizar o preconceito secular atribuído à doença.
O agravo atinge principalmente a pele e os nervos periféricos, podendo causar lesões neurais. As incapacidades físicas em decorrência da infecção são a principal causa de estigma e discriminação dos pacientes. O tratamento é realizado a partir da combinação de diferentes antibióticos, a chamada poliquimioterapia (PQT).
O Sistema Único de Saúde (SUS) disponibiliza a terapia e acompanhamento da doença em unidades básicas de saúde e em referências. Considerada pela Organização Mundial da Saúde como uma doença negligenciada, a hanseníase está fortemente relacionada às condições econômicas, sociais e ambientais desfavoráveis. No Brasil, as áreas de transmissão estão concentradas principalmente nas Regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste.
O país é o segundo no mundo com o maior registro de novos casos, ficando atrás apenas da Índia. Segundo dados do Ministério da Saúde, em 2017 foram registrados cerca de 26,8 mil novos casos em todo o território nacional.
Permitida a reprodução sem fins lucrativos do texto desde que citada a fonte (Comunicação / Instituto Oswaldo Cruz)
